Wednesday, November 08, 2006

Retrovirales

Introducción. Las proteínas amarilla (EYFP) y azul fluorescentes (ECFP) son variaciones de la proteína verde fluorescente (GFP) expresada por el cnidario Aequorea cnidaria. Debido a su baja toxicidad celular y a no requerir de sustratos o anticuerpos específicos para su detección han sido usadas como marcadores celulares, como genes reporteros y como indicadores de la expresión génica. En la actualidad se ha incrementado el uso de vectores retrovirales para transferir y expresar genes con fines terapéuticos de forma eficiente. Para esto es necesario la transferencia del transgén a líneas celulares empacadoras, tal es el caso de la línea GPE-86 que provee en trans los genes gag,pol y env. Metodología: Se obtuvieron dos construcciones retrovirales que expresan respectivamente las proteínas fluorescentes amarilla y azul, Las células GPE-86, se transfectaron con los plasmidos pLN-ECFP-1 y pLN-EYFP-1,también se transfectó un grupo control con el plasmido comercial que expresa la proteína verde fluorescente. Posteriormente las células se seleccionaron obteniéndose colonias las cuales fueron expandidas para su tratamiento.
Resultados Se detectó la expresión de las proteínas amarilla y verde fluorescentes por medio de microscopia confocal La fluorescencia azul se detectó por medio de microscopía de epifluorescencia y de contraste de fases. Transducción de células C6. Se obtuvo el retrovirus a partir del medio de cultivo de las células empacadoras GPE-86 transfectadas. Por último, los retrovirus así obtenidos fueron empleados para transducir células C6 y se comprobó la expresión de éstas proteínas fluorescentes en éstas células de origen glial, las cuales pueden ser usadas como marcadores celulares o genes reporteros durante la transferencia génica. Mi experiencia en el PAEA me permitió conocer la dinámica de vida de un investigador, tanto en el aspecto académico, como en la formación humana. Además tuve la fortuna de acercarme a diversas áreas de investigación en el área biológica, para esto es de gran importancia la orientación adecuada de un tutor que sirva de puente entre el conocimiento científico y el estudiante que lo aborda. En este sentido, la colaboración de José Segovia , quien es además un gran amigo, es de vital importancia, gracias a sus enseñanzas, que retomando sus palabras dice: la investigación rescata la relación medieval entre el maestro y el aprendiz- he aprendido que la ciencia es una forma de vida , es una inquietud que se cultiva de manera disciplinada y que también es una actividad que se disfruta intensamente.
INTRODUCCIÓN

La introducción de material genético exógeno a células u organismos con fines experimentales se conoce como transferencia de genes, ésta involucra sistemas de transferencia viral y no viral, los sistemas virales incluyen a los retrovirus, en los cuales se inserta el transgén eliminando parte del genoma viral, éstos vectores deben introducirse en líneas de células empacadoras que proveen los genes estructurales gag, pol y env en posición trans , lo que permite la producción de virus pero imcompetentes en su replicación.
Estos sistemas han sido utilizados ampliamente en los estudios sobre la terapia génica de diferentes enfermedades.
Para detectar la expresión del transgén es necesaria la expresión de genes reporteros , se han usado los genes que codifican para la B-galactosidasa , luciferasas, y acetiltransferasas, entre otras, Sin embargo éstas enzimas requieren de cofactores o anticuerpos que deben ser adicionados lo que limita su uso a tejido vivo.
En la actualidad se ha usado ampliamente la proteína verde fluoerescente (GFP) como marcador celular, principalmente en la detección de genes o proteínas durante el desarrollo embrionario, para monitorear eventos celulares dinámicos durante la división celular o como genes reporteros en la transferencia génica; ésta proteína presenta una gran ventaja, su fluorescencia es intrínseca y no requiere de cofactores adicionales.
En éste trabajo se realizó la construcción de vectores retrovirales que expresan las proteínas amarillas y azul fluorescentes, las cuales son variaciones de GFP, éstas proteínas presentan regiones mutadas que favorecen su expresión en células humanas.
Posteriormente se transfectaron en una línea celular empacadora GPE-86,se detectó su expresión por medio de microscopía de fluorescencia y confocal. Por último los retrovirus obtenidos se transdujeron en células C6, las cuales tienen un origen glial, detectándose su expresión por medio de microscopía de fluorescencia.
Estas células marcadas pueden ser usadas ampliamente como genes reporteros durante la transferencia de genes terapeúticos.

MÉTODOS

1.Vectores retrovirales. Se obtuvieron dos construcciones retrovirales que expresan respectivamente las proteínas fluorescentes amarilla y azul, cuyas regiones codificantes se encuentran dirigidas transcripcionalmente por el promotor del citomegalovirus humano (CMV), además contienen un gen de resistencia a neomicina, las regiones promotoras de transcripción viral LTR y una señal psi de empaquetamiento.
2. Cultivos celulares. Las células GPE-86 se cultivaron en medio DMEM-HG (GIBCO) con: 10 % de suero fetal bovino dializado e inactivado, 250 mg/ml de xantina, 15 mg/ml de hipoxantina, 150 mg/ml deL-glutamina, 10 mg/ml de timidina, 2 mg/ml de aminopterina y 25 mg/ml de ácido micofenólico. La línea celular C6 derivada de un astrocitoma de murino se cultivó en suero DMEM/¨F-12 (GIBCO) 10% de suero fetal bovino.
3. Transfección de células GPE-86. Las células se transfectaron con los plásmidos pLN-ECFP-N1 y pLN-EYFP-N1, utilizando el kit comercial LipofectAMINE PLUS (GIBCO) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se transfectó un grupo control con el plasmido comercial Living colors (Clontech) el cual expresa la proteína verde fluorescente. Posteriormente las células se seleccionaron con neomicina 400 mg/ml, obteniéndose colonias las cuales fueron expandidas para su tratamiento.
5. Transducción de células C6. Se obtuvo el retrovirus a partir del sobrenadante de las células empacadoras GPE-86 transfectadas con los plasmidos fluorescentes, posteriormente se realizó la infección de células de origen glial a través del medio de cultivo de las GPE86 filtrado con un filtro millipore (0.45 m ) + 4-8 mg/ml de poybrene (SIGMA).
4.Microscopía de fluorescencia. Se detectó la fluorescencia amarilla que emiten las células por medio de microscopia confocal con un microscopio Nikon Diophot (BIORAD) modelo MRC-620 con un flitro para la rodamina y uno para la fluoresceína. La fluorescencia azul se detecó por medio de microscopía de epifluorescencia (Leica) modelo DMLS por medio de un filtro BGR-UV que selecciona longitudes de onda entre 260 y 460 nm, y por contraste de fases,








RESULTADOS


Se transfectaron las células con los plasmidos pLN-ECFP-N1 y pLN-EYFP-N1 respectivamente, después de un tratamiento de selección se obtuvieron colonias que expresan establemente las proteínas amarilla y azul fluorescentes en la línea celular empacadora GPE-86. También se transfectaron transitoriamente un grupo de células GPE-86 control con un plasmido comercial que expresa la proteína verde fluorescente






COLOCALIZACIÓN DE LA PROTEÍNA AMARILLA FLUORESCENTE CON AZUL DE EVANS

A. CÉLULAS GPE-86 TRANSFECTADAS + AZUL DE EVANS
B. CÉLULAS +AZULDE EVANS TRANSFECTADAS CON LA PROTEÍNA AMARILLA.
C. CÉLULAS GPE-86 TRANSFECTADAS CON LA PROTEÍNA AMARILLA FLUORESCENTE.
El panel A muestra un cultivo de células GPE-86 con tinción de evans, la cual tiñe de manera uniforme la célula, la imagen se obtuvo en el canal de la rodamina, el panel B muestra el mismo cultivo transfectado con el plasmido pLN-EYFP-N1 que expresa la proteína amarilla fluorescente tomado en el canal de la fluoresceína, el panel C muestra la colocalización de la tinción de Evans y la proteína amarilla.
LAS IMÁGENES FUERON CAPTURADAS Y ANALIZADAS POR MEDIO DE MICROSCOPÍA CONFOCAL.

EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA AMARILLA FLUORESCENTE EN CÉLULAS C6 TRANSDUCIDAS CON EL RETROVIRUS LN-EYFP


El panel 1 muestra un cultivo de células C6 transducidas con el vector retroviral LN-EYFP-N1
El panel 2 muestra el control de células sin transducir , las imágenes fueron tomadas y analizadas por mediode microscopía de epifluorescencia y confocal.



EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS AMARILLA Y AZUL FLUORESCENTES EN CÉLULAS GPE-86

EN ESTA FIGURA PODEMOS OBSERVAR UN CULTIVO DE CÉLULAS GPE-86 TRANSFECTADAS CON LOS PLASMIDOS AMARILLO Y AZUL RESPECTIVAMENTE Y LA FLUORESCENCIA QUE EMITEN. A LA IZQUIERDA (arriba) OBSERVAMOS EL CULTIVO TRANSFECTADO CON LA PROTEÍNA AZULTOMADO EN CONTRASTE DE FASES (abajo), EL MISMO CULTIVO PERO TOMADO EN EL CNAL DE DAPI (301NM) . A LA DERECHA (arriba) OBSERVAMOS EL CULTIVO TRANSFECTADO CON LA PROTEÍNA AMARILLA (abajo), EL MISMO CULTIVO PERON EN EL CANAL DE LA FLUORESCEÍNA, (430NM).

CONCLUSIONES

1. Se obtuvieron clonas estables de las células GPE86 transfectadas con los vectores previamente construídos: PLN-EYFP-N1 y PLN-EYFP-N1
2. Se observó la expresión de las proteínas amarilla y azul fluorescentes en una línea celular empacadora GPE86.
3. Se obtuvieron retrovirales fluorescentes LN-EYFP y LN-ECFP. Se comprobó la eficacia del retrovirus que expresa la proteína amarilla fluorescente en una línea de células gliales.

0 Comments:

Post a Comment

<< Home